Azul Alcian (para muestras citológicas)

Azul alcian (citologías)

El colorante tienen un carácter básico y soluble en agua. Una característica interesante de está tinción es que dependiendo del pH pueden teñir diferentes tipos de polisacáridos (pH 1.0 para polisacáridos sulfatados, pH 2.5 ácidos siálicos y urónicos).
Esta tinción se utiliza para teñir polisacáridos ácidos como los que se encuentran en el cartílago y otras estructuras. Esta tinción se puede combinar con varias tinciones como las H-E, PAS y Van Gienson.
Hay que destacar que este protocolo está hecho para ser empleado en muestras citológicas, para biopsias el protocolo cambiaría.


Protocolo

• Fijar en alcohol de 96º durante 40 minutos o 1 hora

• Hematoxilina (de Carrazi por ejemplo) durante 5 mintutos

• Lavar con agua 

• Azul alcian 20' 

• 1g de colorante
• 97ml de agua destilada
• 3 ml ácido acético glacial

• Lavado con agua destilada

• Eosina alcohólica 2 minutos

• Deshidratar en alcoholes crecientes hasta llegar a xilol (en cada paso 5 minutos, para una mejor deshidratación).

Resultado

• Mucinas ácidas, proteoglicanos, ácido hialurónico --> azul 

• Glucógeno, mucinas neutras, glicoproteínas --> magenta/rojo

• Mucinas mixtas -->purpura/azul 

Protocolo para Ziehl-Neelsen

Tinción de Ziehl-Neelsen

Esta técnica es usada para la determinación de unas bacterias que son resistentes al alcohol ácido, como puede ser la bacteria de la tuberculosis (Mycrobacterium tuberculosis).  Estas bacterias tienenuna pared característica que les proporciona dicha resistencia. El protocolo siguiente es una variante llamda Tinción de Kinyoun o "en frío", por lo que hay distintos protocolos para este tipo de muestras.

Protocolo

La muestra la comenzamos desde el xilol, se dejan sumergidas en el xilol 20 minutos como mínimo, aunque lo habitual son dos baños de 20 minutos cada uno para quitar los restos de parafina.

·         Hidratación en alcoholes decrecientes para preparar al tejido cuando le vayamos a poner el colorante hidrofílico. Para ello estarán en los alcoholes 100º, 96º, 80, 70, 50º, 5 minutos, terminando en el agua destilada también 5 minutos.

·         Posteriormente lo tratamos con la ferrol fucsina durante 30 minutos, la ferrofucsina se prepara de la siguiente forma:

o   Fucsina básica 0,3 gramos

o   Alcohol 96º 10ml

o   Solución acuosa de fenol al 5 %, 90ml

·         Lavado de agua, preferiblemente de agua destilada

·         Decolorar con alcohol-ácido, el tiempo para este paso depende del tejido del que estemos tratando, por lo que tendremos que tener cuidado en este punto.

o   97ml de alcohol 96º

o   3ml de ácido clorhídrico

Las bacterias y otras estructuras que sean resistentes al alcohol ácido serás las que permanecer con el color mientras que el resto del tejido se decolora y se teñirá con otro colorante de contraste.

·         Lavar con agua corriente durante 8 minutos, con la finalidad de parar la acidez que se le proporcionó en el paso anterior.

·         El colorante de contraste en este caso se utilizará el azul de metileno, pero se puede contrastar con otro colorante que proporcione un color diferente al primero y que se ajuste a las características del ensayo.

o   Por lo que en el azul de metileno estará 30 minutos

§  0,3 gramos del colorante

§  100 ml de agua destilada

·         Después del contraste se lava en agua corriente y a continuación con agua destilada.

·         Finalmente se procede a realizar la deshidratación en alcoholes crecientes terminando en el xilol, en cada uno de los alcoholes tendrá que estar de 2-5 minutos, al igual que en el xilol.

El resultado para esta tinción es:

-          Las bacterias y estructuras alcohol-ácido resistente serán de color rojo

-          El resto del tejido o fondo será de color azul. 

Fig 1. Resultado de la técnica donde se presentan las bacterias alcohol-ácidas resistentes, foto extraída de Wikipedia. 

Referencias
- Foto de Wikipedia que la podéis encontrar junto a más información en: https://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Ziehl-Neelsen

Técnica de Fibras con hematoxilina de Heidenhain

Por el bien de difundir los conocimientos y viendo que, a la hora de aclarar mis dudas sobre la técnica, en Internet no hay nada claro por lo que os dejo el protocolo que he realizado para tejido nervioso. Antes de comenzar, por lo que he visto por Internet, dependiendo del animal del que proceda el tejido las concentraciones de los reactivos pueden variar.

Para empezar se comienza con una hidratación en alcoholes decrecientes durante 5 minutos en cada uno de ellos.

• 96º
• 80º
• 70
• 50

Terminando en dos baños de agua destilada durante 5 minutos cada uno de ellos.

Posteriormente se introduce en el mordiente

• Ferric ammonium sulfate (FAS) al 2,5% durante 45 minutos

Después de este paso lo tendríamos que lavar con agua destilada un tiempo para quitar el exceso del mordiente.

Tras el lavado lo introducimos en la solución del colorante, que en nuestro caso es la hematoxilina de Heidenhain 10% y carbonato de litio al 1%

• La hematoxilina de Heidenhain se encuentra en una solución alcohólica, por lo que se realizará tres días antes al uso, con 5g de la Htx de Heidenhain y 50ml de alcohol absoluto mantenido en agitación.

Una vez terminada la Htx, con sus tres días en reposo (sin agitación), se procede a realizar la solución que se va a utilizar, siendo los porcentajes citados anteriormente. Las preparaciones se mantienen en esta solución durante 1h o 2h.

Es importante destacar que la concentración del cloruro de litio hará que la tinción esté más o menos teñida. A mayor concentración de cloruro de litio menos teñido se tendrá el tejido.

Al acabar con la Htx, se lava en agua destilada para retirar el exceso de Htx.

Finalmente para poder montar las preparación se deshidratan en alcoholes crecientes durante 5 minutos

• 80º
• 96º
• 100º
• xilol

El resultado macroscópico esperado, variando las concentraciones de Htx y del Cloruro de litio es este:

Diff-Quick

Tinción Diff-Quick

Descripción

La tinción de Diff-Quick es una de las tinciones empleadas en citología, que por su rapidez, se emplea como técnica de control para verificar si la prueba de extracción de la muestra ha sido satisfactoria. Esta tinción destaca en que la fijación se lleva a cabo por medio de dejar la muestra secar al aire, aunque también podemos ayudarnos de otros medios para aumentar, aún más su rapidez, como utilizar un secador. Además de técnica de control nos ayudará, en algunas ocasiones, a visualizar el citoplasma celular, ya que el núcleo celular se ve muy teñido y no se aprecia muy bien las características nucleares.

Los resultados que vamos a obtener con esta técnica son los siguientes:

·         Núcleos azules violáceos

·         Citoplasma azul claro-rosa

·          Eritrocitos maduros los veremos de un color naranja rosado

·         Nucléolo de color rosa

Protocolo

-      Cuando hayamos extraído la muestra, se extiende en el portaobjetos y se deja secar al aire o utilizando un secador (cuidado con calentar la muestra!!).

-      Sumergimos el porta en el líquido fijador para Diff-Quick durante 1 minuto.

-      Colocamos el porta en el colorante I (sin lavar la muestra previamente) durante 1 minuto.

-      Ponemos el porta en el colorante II (sin lavar la muestra previamente) durante 1 minuto.

-      Lavamos con agua y posteriormente lo dejamos secar al aire o con el secador.

-      Pasamos los portas al xilol y ya estarán listos para montar. 

Papanicolaou

Tinción de Papanicolaou

Descripción

Es la tinción más usada en citología tanto en muestras ginecológicas como no ginecológicas. Se utiliza para la observación del citoplasma y del núcleo de las células con la ayuda de 3 colorantes: hematoxilina de Carazzi, orange G y el EA-31. Estos colorantes no siempre nos lo vamos a encontrar pero serán similares ya que, como siempre, cada laboratorio funciona de una manera distinta. 

Los núcleos se verán teñidos por la hematoxilina de color azul.

Las células acidófilas de color rojo-naranja por el orange G

Las células basófilas de color verde-azul verdoso.

Para el uso de está tinción debe estar la muestra al menos 1h en alcohol de 96º para conseguir fijar la nuestra muestra, si bien es verdad, que cuando tenemos demasiada prisa por ver los resultados este tiempo se puede acortar a 35-45 minutos.

Fig 1. Citología vaginal con tinción de Papanicolaou, con citoplasma naranja las células superficiales, citoplasma azulado en las células intermedias y los núcleos azules. 

Protocolo

• Comenzamos con la fijación en alcohol de 96º 1h (para una fijación óptima)
• Hematoxilina de Carazzi 5 minutos
• Lavar con agua
• Orange G 5 minutos
• Lavar con agua
• EA-31 también 5 minutos 
• Lavar con agua
• Pasar a deshidratar (dependiendo del tiempo del que dispongamos lo mantendremos un tiempo u otro desde unos segundos hasta 5 minutos, 2 minutos es ideal)
• Alcohol 96º 
• Alcohol 96º
• Alcohol 100º
• Alcohol 100º
• Después de la deshidratación pasamos al xilol, donde mantendremos nuestros portas con nuestras muestras hasta que le pongamos el cubreobjetos. 

Tinción Hematoxilina-Eosina

Introducción

De todas las tinciones de las que se puede realizar es sin duda la tinción de hematoxilina-eosina la más común en histología. Es una coloración de tipo topográfica ya que da una visión del conjunto de las estructuras del tejido.

Esta tinción está compuesta por dos colorantes: la hematoxilina, que es un colorante nuclear por lo que tiene un carácter acidófilo, y el otro colorante es la eosina, este colorante es citoplasmático o en otras palabras basófilo. 

La afinidad de un colorante por una determinada estructura es el radical del auxocromo, según dicho radical podrán ser ácidos, básicos, neutros y/o indiferentes. Como hemos dicho anteriormente, la hematoxilina se une al núcleo (estructura ácida) por lo que este colorante será básico. La eosina en cambio se une a estructuras básicas (como las proteínas que hay en el citoplasma) por lo que este colorante será ácido. 

Hematoxilina 

Primero hay que destacar que la hematoxilina no es el verdadero colorante sino el producto de la oxidación de éste, llamado hemateína. 

Además requieren de un mordiente, el alumbre potásico o amónico denominado hemalumbre

• hematoxilina de Harris alumbre potásico
• hematoxilina de Mayer alumbre amónico
• hematoxilina de Weigert alumbre férrico
• hematoxilina de Carazzi alumbre potásico
• entre otras.

Cada una de las hematoxilina nos será útil para una determinada tinción.

Produce un color azul negruzco.

Eosina

Es un derivado xanténico. Hay dos tipos de eosinas, atendiendo a su composición:

• Eosina Y con 4 átomos de Br
• Eosina B con 2 átomso de Br

Se pueden usar en solución acuosa o alcohólica dependiendo de la tinción.

Produce un color rojo.

Procedimiento

• Los cortes a teñir han de estar desparafinados, para ello se hacen baños en xilol 20 minutos
• Hidratación de los cortes:
• Alcohol 100º durante 2-5 minutos
• Alcohol 100º durante 2-5 minutos
• Alcohol 95º durante 2-5 minutos
• Alcohol 95º durante 2-5 minutos
• Agua corriente 2-5 minutos
• Hematoxilina de Harris durante 10 minutos. Si se utiliza este tipo de hematoxilina se aconseja diferenciar.
• Lavar con agua corriente hasta que el tejido deje de soltar colorante.
• Diferenciación:  con una solución alcohol-ácida 1% hasta que veamos necesario, suelen ser unas pocas pasadas dependiendo del tipo de muestra.
• Agua amoniacal 2% unos pocos segundos, para estabilizar la hematoxilina, además produce un azuleado. 
• Lavado con agua corriente
• Eosina alcohólica 3 minutos, al ser alcohólica en los alcoholes se nos diferenciará un poco.
• Deshidratación, para preparar la muestra antes de introducirla en el xilol.
• Alcohol 95º durante 2-5 minutos
• Alcohol 95º durante 2-5 minutos
• Alcohol 100º durante 2-5 minutos
• Alcohol 100º durante 2-5 minutos
• Xilol y montar el portaobjetos con nuestro medio de montaje como puede ser el DPX o Entellan

Resultados

Núcleos azules oscuros

Citoplasmas rosa

Fibras musculares y hematies rojos

Fig 1. Glomérulo de un riñón teñido con hematoxilina eosina

Introducción Teórica

Objetivo

Visualización y/o determinación de determinados componentes celulares presentes en un tejido.

Características

Se utilizan una serie de moléculas específicas llamadas anticuerpos, los cuales pertenecen a la familia de las inmunoglobulinas. Estos anticuerpos tienen la peculiaridad de que pueden unirse a una determinada molécula (antígeno) de una forma muy específica. Dependiendo del tipo de técnica de la que se hable se podrá clasificar en inmunofluorescencia o inmunohistoquímica, si tienen una molécula asociada a la parte constante del anticuerpo que produce una luz con una determinada longitud de onda mayor a la absorbida (fluoróforo) o si tienen una enzima (como la peroxidasa) que produce en ultima instancia una molécula con color. además se pueden clasificar en directa o indirecta si el anticuerpo marcado es el que se une al antígeno o se requieres de un anticuerpo puente (llamado anticuerpo primario) 

Anticuerpo 

Es una glicoproteína compuesta por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, representado comúnmente con una forma de "Y". En el extremo amino (NH2) terminal de cada una de las cadenas se caracteriza por ser una región muy variable, la cual será la causante de unirse a nuestro antígeno.

Los anticuerpos tienen su origen en las células B maduras (células plasmáticas) de los vertebrados, que los secretan en el torrente sanguíneo para que puedan unirse al agente patógeno (antígeno), este proceso forma parte de la respuesta inmunitaria celular. 

Para más información: anticuerpo

Antígeno

Es cualquier sustancia extraña al sistema inmunitario por lo que provocará una respuesta inmune con una intensidad dependiendo principalmente del tamaño y de la composición de dicha sustancia. Por lo que, nuestro sistema inmune detectará como antígenos a moléculas determinadas de bacterias, virus, protozoos, hongos, células eucariotas de una especie diferente o de una misma especie, incluso el sistema inmune reacciona contra el propio organismo como es el caso de las enfermedades autoinmunitarias o en el caso de células que se formaron después de que el sistema inmune del individuo madurase, como es el caso de los espermatozoides.  

Más información en Antígeno

Epítopo 

Es la región del antígeno causante de la reacción antígeno-anticuerpo.

Paratopo

Es la región del anticuerpo causante de la reacción antígeno-anticuerpo.

Conclusión

Las técnicas inmunológicas se aprovechan de las características que presentan los anticuerpos para detectar diferentes moléculas de interés. Se podrá visualizar la presencia de dicho antígeno por fluorescencia con la ayuda de un microscopio de fluorescencia, o bien, si se utilizó una técnica inmunoenzimática o inmunohistoquímica con el microscopio óptico.

Fig 4. Técnica inmunohistoquímica

Fig 3. Técnica de inmunofluorescencia

Pueden consultar además un vídeo explicativo sobre el tema en el siguiente enlace https://youtu.be/uiZPWNTZ6aA